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抗体FC验证应用实验步骤详解
发表时间：2023-04-10
一、细胞表面染色操作流程
①细胞计数
细胞计数：将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数；500g离心4min，去上清。
②制备单细胞悬液
将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬，400g离心3min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl细胞悬液。
③（可选）阻断Fc受体
室温孵育10-20min。
④一抗孵育
每孔加入稀释后的一抗溶液100μl，2-8℃反应30min。
⑤洗涤
400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
⑥二抗孵育
对于非荧光染料直标抗体，加入100μl荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤8。
⑦ 洗涤
400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
⑧重悬细胞
用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。
二、细胞胞内染色操作流程
①细胞计数
将培养好的细胞收集于15mL离心管并计数；500g离心4min，去上清。
②制备单细胞悬液
将收集的细胞用1mL 0.5%BSA/PBS溶液重悬，400g离心3min，去上清，重复2次；用0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞至浓度1x106个细胞/mL，分配到96孔板中，每孔100μl细胞悬液，400g离心5min去上清。
③固定
每孔加入100μl细胞固定剂重悬细胞，2-8°孵育20min。
④洗涤
400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
⑤洗涤
每孔加入100μl细胞通透剂重悬细胞，室温孵育20min。
⑥洗涤
400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
⑦ (可选）阻断Fc受体：
10-20min。
⑧一抗孵育
每孔加入稀释后的一抗溶液100μl，2-8℃反应30min。
⑨洗涤
400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
⑩二抗孵育
对于非荧光染料直标抗体，加入100μl荧光二抗重悬，避光2-8℃反应30min。对于直标抗体直接跳到步骤11。
?洗涤
400g离心5min，去上清后加入200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬，离心去上清，重复两遍。
?上机分析
用200μl 0.5%BSA/PBS溶液重悬细胞，4℃保存，上机分析。
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FineTest®antibody
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End
